瓶裝水中含有數十萬先前未檢測到的納米塑料顆粒
微（納米）塑料已成為日益凸顯的全球性環境問題。納米塑料尺寸遠小於微塑料，由於缺少有效的分析技術，人們對納米塑料的了解非常有限。
來自美國哥倫比亞大學和羅格斯大學的研究人員開發了一種強大的光學成像技術，首次對納米塑料進行了計數和識別，發現每升瓶裝水中大約含有240000個微（納米）塑料顆粒，這一數字是前期基於較大尺寸顆粒估算值的10~100倍。1月9日，相關研究發表在《美國國家科學院院刊》上。
無論是極地冰川、土壤、飲用水還是食物中，微塑料（直徑介於1微米到5毫米）無處不在。與天然有機物不同，大多數塑料不能分解成相對無害的物質，而是分解成更小的微塑料微粒。
納米塑料源自微塑料的進一步分解，直徑小於1微米。因其尺寸極其微小，可以穿過大腸和肺部，直接進入血液循環系統，再進入心臟和大腦等人體器官。納米塑料甚至可以貫穿胎盤進入到胎兒體內。
“這是一個未被完全探索的新領域。以往研究大多在推測潛在物質的基礎上展開，而我們的研究則為深入探索這個全新的納米塑料世界打開了一扇窗。”論文通訊作者之一、哥倫比亞大學拉蒙特-多爾蒂地球觀測站（LDEO）的環境化學家顏備戰在接受《中國科學報》采訪時說。
“此前，人們開發出了觀察納米粒子的方法，但傳統的方法無法提供鑒別這些顆粒化學組成的信息。”論文第一作者、哥倫比亞大學化學系博士生錢乃馨告訴《中國科學報》，“以往的研究是把水中收集到的所有物質作為一個整體來分析，無法在計數單個顆粒的基礎上識別哪些是塑料或是其它物質。”
這項研究使用了先進的受激拉曼散射顯微技術，該技術由論文另一位通訊作者、哥倫比亞大學生物物理學家閔瑋共同研發。研究人員針對七種常見納米塑料創建了基於數據驅動的算法來解析結果，並發現納米塑料的質量占比遠低於微塑料。但閔瑋教授認為，“重要的不是質量，而是數量。因為顆粒越小，雖然質量占比更少，但更易進入人體。”
通過該技術檢測瓶裝水，研究人員發現每升水中可能含有11萬到37萬不等的可識別塑料顆粒，其中90%是納米塑料，直徑可低至100納米。他們還確定了這些納米塑料是七種特定塑料中的哪一種，這些特性在生物醫學研究中可能很有價值。這項研究有望在納米水平上彌合塑料汙染方面的知識差距。（來源：中國科學報張晴丹） 相關論文信息：https://doi.org/10.1073/pnas.2300582121
作者：顏備戰等 來源：《美國國家科學院院刊》 發布時間：2024/1/9 10:51:43
https://paper.sciencenet.cn/htmlpaper/2024/1/2024191051435993203.shtm
利用 SRS 顯微鏡對奈米塑膠進行快速單顆粒化學成像
錢 乃新https://orcid.org/0000-0001-6433-063X、高新 https://orcid.org/0000-0002-0911-3656 、郎曉琪 ,+5 和魏敏 https://orcid.org/0000-0003-2570-3557 wm2256@columbia.edu 作者資訊和隸屬關係
由加州大學歐文分校的 Eric O. Potma 編輯； 2023 年 1 月 11 日收到；編輯委員會成員 Shaul Mukamel 於 2023 年 10 月 24 日接受2024 年 1 月 8 日 121 (3 )e2300582121
https://doi.org/10.1073/pnas.2300582121
意義
源自塑膠普遍使用的微奈米塑膠在全世界範圍內引起了越來越令人擔憂的擔憂。然而，由於缺乏有效的分析技術，奈米塑膠仍存在基礎知識差距。這項研究開發了一種強大的光學成像技術，能夠以前所未有的靈敏度和特異性快速分析奈米塑膠。作為演示，透過對單個塑膠顆粒進行多維分析來分析瓶裝水中的微奈米塑膠。定量顯示每公升瓶裝水中含有超過 105 個顆粒，其中大部分是奈米塑膠。這項研究有望彌合奈米級塑膠汙染的知識差距。
抽象的
如今，塑膠在我們的日常生活中無所不在。微塑膠（長度為 1 µm 至 5 mm）甚至奈米塑膠（<1 µm）的存在最近引起了健康問題。特別是，奈米塑膠被認為毒性更大，因為與微塑膠相比，其較小的尺寸使其更容易進入人體。然而，檢測奈米塑膠對奈米級靈敏度和塑膠識別特異性都提出了巨大的分析挑戰，導致我們周圍這個神秘的奈米世界存在知識差距。為了應對這些挑戰，我們開發了一個高光譜受激拉曼散射（SRS）成像平台，該平台具有自動塑膠識別演算法，可以在單顆粒層級進行微奈米塑膠分析，具有高化學特異性和通量。我們首先驗證了 SRS 窄帶的靈敏度增強，以實現 100 nm 以下的高速單一奈米塑膠檢測。然後，我們設計了一種數據驅動的光譜匹配演算法，以解決敏感窄帶高光譜成像帶來的光譜識別挑戰，並實現對常見塑膠聚合物的穩健測定。利用現有技術，我們研究了瓶裝水中的微奈米塑膠作為模型系統。我們成功地從主要塑膠類型中檢測並鑑定出奈米塑膠。據估計，每公升瓶裝水中的微奈米塑膠濃度約為2.4±1.3×10
5 個顆粒，其中約90%是奈米塑膠。這比之前報導的瓶裝水中的微塑膠豐度高出幾個數量級。高通量單顆粒計數揭示了塑膠成分和形態之間非凡的顆粒異質性和非正交性；由此產生的多維分析揭示了奈米塑膠科學。
訂閱 PNAS 警報。
取得新文章提醒，或在文章被引用時取得提醒。 塑膠汙染已成為全球日益關註的問題，塑膠消耗量逐年增加(1 )。環境中幾乎所有地方甚至人類生物樣本中都普遍存在微塑膠汙染 (2 –4 )。此外，越來越多的發現表明，塑膠聚合物的碎裂不會停止在微米水平，而是繼續形成奈米塑料，其預期數量要高出幾個數量級 (5 )。透過帶有螢光染料或金屬標記的工程塑膠顆粒，研究人員已經證明了奈米塑膠跨越生物屏障並進入生物系統的可能性(6-9 ) ，引起了公眾對其潛在毒性的擔憂(10 )。
儘管迫切需要評估這個問題，但奈米塑膠分析對於傳統技術仍然具有挑戰性。與實驗室製備的工程奈米顆粒作為模型系統不同，環境中的真實奈米塑膠本質上是無標記的，並且在化學成分和顆粒形態方面具有顯著的異質性 (11 )，這可能會承受相應不同的毒性影響 (12 ,13 )。為了解決奈米塑膠在這種異質群體中編碼的來源、豐度、命運和潛在毒性方面現有的知識差距，具有化學特異性的單粒子成像無疑對於避免整體測量中資訊的遺失至關重要。然而，傳統的單顆粒化學成像技術，即 FTIR 或拉曼顯微鏡，儀器分辨率和檢測靈敏度相對較差 (14 ,15 )，這限制了它們僅在微塑料水平上成功揭示異質性 (16 ,17 )。對塑膠顆粒具有奈米敏感性的顆粒成像技術，例如電子顯微鏡和原子力顯微鏡，缺乏區分不同成分的關鍵化學特異性（18、19）。已經做出了廣泛的努力；然而，大多數技術仍然受制於靈敏度和特異性之間的基本權衡，這是分析科學中反覆出現的主題 ( 15 , 20 )。最近由 AFM-IR 和 STXM ( 21 – 23 )證明的化學光譜單顆粒成像往往吞吐量太低（塑料識別光譜>10 min/μm 2在此，我們引入了數據科學驅動的高光譜受激拉曼散射（SRS）顯微鏡作為奈米塑膠檢測的強大平台，以滿足這三個要求。 SRS 顯微鏡利用受激拉曼光譜作為成像對比機制，並且在生物醫學成像中的實用性不斷增加 (24 –27 )。雖然 SRS 通常被認為可以將常規拉曼成像速度提高 1,000 倍以上 (26 –29 )，從而能夠快速識別微塑膠 (30 ,31 )，但它分析奈米塑膠的實用性仍有待探索。為了最大限度地提高單粒子檢測所需的靈敏度，我們採用了窄帶 SRS 成像方案，將刺激光束的所有能量聚焦到具有最大拉曼截面的目標特徵振動模式 (32 )。然後，我們從理論和實驗證明，窄帶 SRS 成像可以檢測小至 100 nm 的奈米塑膠。然而，僅來自高於檢測極限的最強振動特徵的有限光譜特徵對自動光譜識別提出了挑戰，這對於高通量塑膠顆粒分析至關重要。為了解決這種基本的靈敏度-特異性權衡問題並充分發揮高光譜 SRS 成像的潛力，我們基於七種常見塑膠標準的光譜庫設計了一種數據驅動的 SRS 客製化光譜匹配演算法。在數據科學的幫助下，成功地恢復了 SRS 光譜形式的振動特徵的內在化學特異性，用於奈米塑膠檢測的自動聚合物識別。 配備該平台後，我們研究了日常飲用的瓶裝水中的微奈米塑料，作為現實樣品的原型。鑑定了庫中所有七種塑膠聚合物的單一顆粒，從而能夠對尺寸小至 100 至 200 nm 的塑膠顆粒進行統計分析。使用特定的聚合物成分來估計微奈米塑膠的暴露量。整合來自成像的形態訊息，報告了單一塑膠顆粒的多維表徵，揭示了我們周圍隱藏的微奈米世界中塑膠顆粒的全方位異質性。
1. 具有單粒子靈敏度的聚苯乙烯奈米球的 SRS 成像
眾所周知，SRS 顯微鏡比常規拉曼成像快幾個數量級 (25 ,26 )。 SRS 顯微鏡的成像速度顯著提高，因此可以提供高通量的粒子成像。然而，高速SRS是否比常規拉曼具有更好的檢測極限以及是否真正能夠達到奈米塑膠的單粒子靈敏度尚不明顯。理論上的量化有助於先解決這個問題。對於給定的主要類型的塑膠聚合物，我們可以根據塑膠密度來估計直徑為100奈米的奈米塑膠的質量，並透過其分子量來計算重複單元（即構成單體）的數量。如SI附錄表S1所示，大多數主要塑膠類型的這個數字約為106，據此我們可以進一步估計單一塑膠顆粒中最豐富的化學鍵數量約為107。 然後我們可以從理論上解釋為什麼 100 nm 奈米塑膠顆粒很難透過傳統拉曼顯微鏡檢測到。典型的C-H振動的自發拉曼截面約為10-29 cm2。因此，100nm奈米粒子的自發拉曼截面為10-22 cm2。在高數值孔徑顯微鏡物鏡下，雷射腰區可縮小至約2×10-9 cm2 。每個激發光子的拉曼散射事件的機率為(10-22 cm2 )/(2 × 10-9 cm2 ) = 5 × 10-14。假設傳統 532 nm 雷射具有 10 mW 的中等高雷射功率，對應於 3 × 1016光子/s 的激發通量，以及100 ms 的相當長的採集時間（一個小的128 × 128 影像將花費一半的時間）。考慮到整個儀器（包括物鏡、濾光片、針孔、光譜儀和相機）的量子產率通常約為 1%，最終大約只能檢測到 1.3 個光子。這種微弱的訊號很容易被其他背景（例如自發螢光）的雜訊所淹沒。 透過採用額外的相幹斯托克斯雷射，SRS 透過量子激勵放大特定光譜模式（由泵浦雷射和斯托克斯雷射之間的能量差定義）的微弱散射截面。當使用脈衝窄帶斯托克斯雷射(24、33 )時，受激拉曼增強因子可以最大化至超過10 8 (32、34 )。每個泵浦激發光子發生受激拉曼散射事件的機率變為 5 × 10 -6，其測量為針對 C-H 振動的泵浦光束所經歷的受激拉曼損耗。高速 SRS 顯微鏡擷取（18 µs/像素）下泵浦光束的雜訊測量為 5 × 10 -7（圖 1），比單一雷射器的預期受激拉曼損耗訊號低約 10 倍。因此，我們預測窄帶 SRS 將打破自發拉曼的可偵測性障礙，並在短短數十微秒內將單一奈米塑膠顆粒帶入檢測中。
，在 3,050 cm -1處測量），以直徑（μm）表示的粒徑對數。紅色虛線顯示斜率為 2.98 的線性擬合 (R 2 = 0.998)。誤差條，平均值±SD。紅色實線表示散粒雜訊限制的 SRS 偵測極限，其中 SNR = 1。 然後，我們使用標準塑膠顆粒透過實驗驗證檢測靈敏度。聚苯乙烯是日常生活中廣泛使用的最常見塑膠之一。特定尺寸的聚苯乙烯顆粒可作為分析標準品在商業上購買，並且通常用作研究微奈米塑膠的模型材料（35、36）。聚苯乙烯的拉曼光譜表明，苯環上芳香族 C-H 振動在 3,050 cm -1處有一個突出的峰值（ SI 附錄，圖 S1），可以透過調節泵浦光束和斯托克斯光束的差異來選擇性放大該峰值以進行SRS 成像來匹配這個躍遷能量。使用 100 nm 至 3 µm 的商用 PS 微奈米球，我們評估了 SRS 顯微鏡在奈米塑膠成像中的檢測靈敏度。為了在成像過程中穩定顆粒，我們將稀釋的 PS 顆粒嵌入瓊脂糖凝膠中。隨著粒徑變小，3,000 cm -1附近的水背景殘留開始占主導地位（SI附錄，圖S2 a），壓倒了單一PS奈米顆粒的真實光譜。為了解決這個背景問題以獲得更好的成像對比度，我們用D 2 O取代常規H 2 O來製備瓊脂糖凝膠（SI附錄，圖S2b ）。與H 2 O相比，D 2 O的拉曼光譜紅移至靜音區（2,200至2,800 cm -1，SI附錄，圖S3），為偵測C-H振動創造了無背景的環境。
因此，可以透過高通量的單通道窄帶成像來測量單一顆粒的 SRS 強度（2 秒內在 51 × 51 µm FOV 中約 1,000 個顆粒，
SI 附錄，圖 S4）。此成像速度比其他奈米塑膠成像技術（例如 AFM-IR 和 STXM）快幾個數量級（21、23、37）。在光學衍射極限下，測得SRS顯微鏡的最佳空間解析度為365 nm（圖1 H和I）。透過對 200 nm 像素大小的空間採樣進行高通量成像，可以從影像中辨別出 500 nm 以上的單一 PS 奈米球的形狀（圖 1 D- G）。當顆粒尺寸小於衍射極限時（圖 1 A – C），有限的光學解析度使顆粒影像呈現衍射極限圖案。然而，基於衍射極限圖案和強度分佈，仍然可以輕鬆識別低至100 nm的單一粒子的SRS強度（SI附錄，圖S5）。因此，我們透過實驗證明，與常規自發拉曼相比，SRS 成像可以提供高幾個數量級的成像速度/吞吐量以及奈米塑膠分析的卓越檢測極限。
SRS 訊號的對數之間觀察到線性關係（ ）和小於0.7 µm的PS顆粒直徑的對數（圖1 J和SI附錄，補充說明3）。範圍內斜率為 2.98 的趨勢線表示 SRS 訊號（ ) 隨顆粒體積線性增加，隨著顆粒直徑的增加，顆粒體積以立方比例縮放。當顆粒尺寸增大以在第一個 x、y 和後面的 z 維度上依序充滿有效焦體積時（SI 附錄，圖 S14），線性相關性消失。這種良好的線性度 (R2 = 0.998) 是由於 SRS 訊號對目標分析物濃度的基本線性依賴性，在多個方面提供了強大的實用性。首先，可以根據所獲得的校準曲線（SI附錄，圖S16a ）估計低於衍射極限的顆粒的實際尺寸，從而擴展了尺寸表徵極限。其次，利用已知的塑膠密度訊息，可以將相同的校準曲線轉化為參考，以從檢測到的 SRS 奈米塑膠影像中推斷出顆粒質量（SI 附錄，補充說明3和圖 S16 b）。最後，以SNR為1作為閾值，可以確定我們的窄帶SRS顯微鏡的檢測極限（圖1K ）以達到低至60 nm的PS奈米球。
2. 高光譜 SRS 成像化學鑑定奈米塑膠的基本挑戰
奈米靈敏度解決了第一級問題，確保塑膠顆粒可被檢測到。技術的化學特異性對於識別塑膠與其他共存物質以及進一步區分塑膠聚合物也至關重要。利用振動光譜作為成像對比，SRS 顯微鏡原則上可以滿足化學成像所需的特異性。在儀器上，我們透過光譜聚焦技術進行高光譜 SRS 成像 (38 ,39 )。為了在儀器的調諧範圍（790至910 nm）內最好地覆蓋塑膠拉曼光譜（SI附錄，圖S1 ）的特徵，我們精心選擇793、804、886和897 nm作為四個中心波長包括C– H（不飽和和飽和碳，3,110 至2,800 cm-1）、酯鍵（1,770 至 1,670 cm-1）和雙鍵振動（1,660 至 1,580 cm-1）的強特徵光譜特徵圖 2 A）：聚醯胺66 (PA)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚氯乙烯(PVC) ）、聚苯乙烯（PS）和聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET），具有精細的光譜間隔（~3 cm-1）。 圖 2.
與批量光譜測量不同，奈米塑膠的單顆粒成像需要更小的像素尺寸、更長的積分時間和更高的功率才能實現最佳信噪比。因此，由於檢測靈敏度和特異性之間的根本權衡，幾乎不可能以如此精細的光譜間隔測量奈米塑膠（每個視場的成像時間為數小時，在此期間樣品漂移和燃燒的可能性增加）。此外，基於光譜聚焦的高光譜SRS顯微鏡的光譜解析度通常為10至25cm-1。為了實現吞吐量和光譜分辨率之間適當平衡的高效高光譜成像，我們進一步對光譜進行二次採樣（SI附錄，圖S6），光譜間隔約為15 cm-1，僅略高於光譜分辨率並產生可接受的成像奈米塑膠單顆粒化學成像的吞吐量（每 0.2 mm × 0.2 mm FOV 約 0.5 小時）。 高通量塑膠顆粒分析還需要自動光譜分析來進行塑膠識別。基於 FTIR 或拉曼光譜的微塑膠分析普遍採用自動化學辨識的光譜匹配演算法 (40 ,41 )。在典型的環境研究中需要分析數千個粒子光譜，手動塑膠識別和計數不僅是不可能的勞動密集型，而且還容易受到人為偏差的影響 (14 ,40 –42 )。自動顆粒分析有助於加快測量速度、分析更多顆粒，並確保普遍且公正的塑膠辨識。在了解環境科學對自動化的需求後，我們開始在 FTIR 和拉曼分析中應用經典的庫匹配演算法，但發現它們與窄帶 SRS 高光譜分析不太相容。以研磨PA標準品製備的粒子A的檢測光譜為例（圖2B ）。經過背景扣除和資料歸一化的光譜預處理後，粒子 A 的光譜與聚醯胺的 SRS 特徵明顯匹配。然而，當使用常見的光譜匹配演算法 (42)（例如皮爾森相關係數 (PC) 或平方歐幾裏德餘弦 (SEC) 測量）測量顆粒 A 與庫中散裝塑膠標準品的光譜相似性時，識別結果似乎難以捉摸（圖42）。在實際樣品分析中，不應該假設粒子 A 應該屬於庫中的任何標準塑料，這意味著必須根據給定的閾值對每個塑料標準獨立做出是或否判斷。微塑膠的FTIR 或自發拉曼分析中採用的常見閾值是高於0.7 的相似性測量，這顯然太低而無法識別粒子A。的相似性閾值高光譜 SRS 成像下的奈米塑膠分析。然後可以基於識別至少 95% 的 PS 顆粒的四分位數來確定相似性閾值（PC 的相似性指數高於 0.75，SEC 的相似性指數高於 0.94）。然而，在粒子A 的情況下，進行二元識別判斷的挑戰性部分仍然存在，因為三種塑膠聚合物（PA、PP 和PVC）的相似性測量值在數量上非常接近，並且都高於閾值（圖 2 D和E））。需要註意的是，不能簡單地在所有標準中選取最好的分數，因為在實際樣品分析中，A完全有可能是非塑膠材料。事實上，如果我們基於以大腸桿菌為代表的生物質模型標準光譜來模擬可能的非塑膠 SRS 光譜，則超過 95% 的光譜將在兩種演算法的給定閾值上與 PA 標準具有相似性測量（SI 附錄，圖S12a和b )。 我們認為，上述困難的主要原因源自於檢測靈敏度和特異性之間的權衡。強調化學特異性，自發拉曼光譜或其他寬頻相幹拉曼顯微鏡可以透過在大量拉曼振動模式之間分配光功率來覆蓋擴展的光譜視窗（>1,000 cm-1 ）。豐富的光譜資訊可以透過簡單的演算法實現化學識別，但代價是在有限的像素停留時間下檢測靈敏度會降低數千倍（ 43-45）。然而，在奈米塑膠分析的背景下，檢測顆粒訊號是從振動光譜進行化學識別的前提。為了在實際吞吐量下測量盡可能小的塑膠顆粒，最終只有最強的拉曼特徵才能以合理的信噪比被檢測到。對於大多數本質上是有機聚合物的塑膠來說，最強的拉曼特徵存在於有限的 C-H 振動窗口內。在這種情況下，特定的化學物質識別需要演算法在有限的光譜視窗內精確捕捉形狀特徵，這超出了傳統光譜匹配演算法的能力。此外，在對微小奈米粒子進行成像時，訊號雜訊比不可避免地會受到損害和限制，這給光譜解釋和穩健化學鑑定帶來了進一步的挑戰。因此，需要新的方法來解決 SRS 儀器帶來的特異性挑戰，以實現奈米塑膠成像前所未有的靈敏度。
3.數據驅動的SRS定制光譜匹配演算法恢復化學特異性
利用數據科學，我們的目標是開發演算法來解釋檢測到的 SRS 特徵的形狀並檢索聚合物識別的化學特異性。首先，開發了 SRS 定制的光譜匹配係數（SMCSRS）作為量化光譜相似性並最小化噪音幹擾的指標（圖 2，等式 1）。 SMCSRS使用考慮偵測到的 SRS 頻譜的最佳化演算法源於縮放（強度因子 α ) 歸一化本體標準譜 加上成像條件下的一定背景貢獻（ β , β<1）。擬合的頻譜（ αβ ）與檢測到的粒子光譜進行比較 求 SMCSRS的最小可能光譜距離。 SMCSRS值越小，表示與對應標準的光譜相似度越高。 SMCSRS指標為檢測奈米塑膠提供了多種優勢。最佳化演算法同時考慮所有譜點，減少了雜訊對每個特定譜點的直接影響。擬合過程利用了相似性測量的可靠性。此外，測量結果是可解釋的。明確定義的強度因子 α 和背景因子 β 可以指示每個光譜分量（粒子和周圍背景）的貢獻。最後，光譜距離測量提供了度量相似性評估。 透過以這種精確的方式量化光譜相似性，我們再次面臨對聚合物識別進行非任意二元判斷的挑戰。我們計劃開發一種基於學習的方法來確定先前難以捉摸的二元閾值來識別所有塑膠聚合物。我們的前提是，如果我們能夠測量庫中所有類型塑膠的奈米粒子光譜，我們將能夠從數據中學習，並根據已知身份的粒子的分佈繪製正確的邊界進行識別。然而，實際上，商業上只有具有明確化學成分和奈米尺寸的 PS 奈米球可供我們購買。如果沒有其他聚合物奈米粒子的可靠基礎事實，我們必須尋找替代方法來收集嚴格閾值確定所需的大量資訊。 受到人工智慧中合成數據的不斷增加的實用性（46）以及數據科學在 SRS 顯微鏡中的越來越多的參與（47-49 ）的啟發，我們意識到我們可以從散裝標準光譜中模擬奈米塑料的實驗SRS 光譜，以作為訓練資料集（即合成資料）。基於我們對 SRS 儀器的理解，我們提出了一個模型，其中典型的高光譜 SRS 頻譜中有兩個主要噪聲源：一個是散粒噪聲限制場景中 SRS 強度的基本噪聲，可以將其表示為從同一張SRS 影像中輕鬆讀出；另一個是SRS儀器帶來的頻率不確定性，其中雷射輪廓和移動延遲台都會導致每次測量中在預設光譜點周圍激發的實際頻率波動。假設波動遵循高斯分佈，我們使用PS奈米球作為標準模型來研究波動範圍，並從PS奈米粒子的合成光譜和測量光譜中發現SMCSRS計算具有令人印象深刻的一致性（SI附錄，補充說明2和圖1）。噪音源的組合性質解釋了 SMCSRS值對頻譜強度的依賴性（ α ），如模擬所示並經實驗驗證（圖 2 F）。 對庫中的所有標準應用相同的模型，我們產生了一個合成資料集，其中包含塑膠庫中每種聚合物奈米塑膠的可能 SRS 光譜。顆粒光譜間出現SMCSRS值的良好分離（ ，R是標準聚合物的正確身份）和顆粒光譜 （ ）在所有散佈圖中（SI附錄，圖S11）。利用大量產生的合成資料點，根據散點的趨勢擬合對數函數作為聚合物識別的閾值線（SI附錄，補充說明2和表S2）。 我們首先透過模擬庫中所有標準的另一個合成資料集作為測試資料來評估識別性能。與傳統的光譜匹配演算法相比，SRS 客製開發的塑膠識別誤報率極低（SI 附錄，圖 S12）。不超過 0.5% 的非塑膠光譜（模擬自大腸桿菌）被錯誤識別為庫中任何塑膠類型的命中（SI 附錄，圖 S12 c），這比使用傳統光譜匹配的 97% 以上有了巨大改進演算法（SI附錄，圖S12 a和b）。類似 SRS 光譜的聚合物之間的假陽性也大大減少，最大約為 5% PA 被誤識別為 PP（SI 附錄，圖 S12 c）。如果使用PC或SEC作為與確定閾值的相似性測量，相同的數字也高達97％以上（SI附錄，圖S12 a和b）。 為了進一步解決可能出現的罕見情況，即某個顆粒被識別為庫中多種聚合物的命中，相應顆粒的化學特性將分配給具有最小 SMCSRS值的聚合物。透過建立的光譜辨識工作流程，庫中所有聚合物的辨識率可以達到96%以上，假陽性率低於1%（SI附錄，圖S12d ）。由於 PS 奈米球是唯一可用的奈米塑膠標準品，因此工作流程的實驗驗證是基於使用低溫研磨機研磨聚合物標準品製備的相應微塑膠的成像。為了最大程度地模擬類似水平的光譜變化，成像條件會相應調整以匹配奈米塑膠測量的信噪比。最後，我們在實驗顆粒測量中確認了超過 96% 的相同識別率，沒有觀察到塑膠顆粒被誤識別為庫中的其他聚合物（圖 2 G）。 這種數據驅動演算法的開發可以在有限的光譜視窗中識別具有不同振動特徵的每種塑膠聚合物，從而檢索自動光譜識別所需的化學特異性。重新審視粒子 A 和標準 PS 奈米球 B 的識別，我們可以在整個庫中正確識別粒子 A 和粒子 B 為 PA 和 PS（圖 2 H- N），SMCSRS很好地捕捉了傳統方法遺漏的形狀差異從數據驅動的研究中學到的演算法和閾值。將數據科學的思維方式與先進的測量科學相結合，我們最終克服了高通量高光譜 SRS 分析的基本靈敏度-特異性權衡。同時實現窄帶 SRS 擴增帶來的卓越奈米靈敏度和具有強大化學鑑定功能的化學特異性，以填補奈米塑膠分析工具中缺少的空白。
4. 開發瓶裝水中微奈米塑膠檢測的工作流程
平台建立後，我們繼續應用該實用程式來研究現實樣品中的微奈米塑膠。微塑膠廣泛存在於人類食品 (50 )、飲料 (51 ) 和產品包裝 (52 –55 ) 中，其中瓶裝水尤其令人關註，因為它是日常生活中攝入的微塑膠的重要來源 (56 –59）。受限於分析科學中敏感性與特異性的權衡（SI附錄，圖S18 b），文獻知識僅限於瓶裝水中的微塑膠（SI附錄，表S4）（19 ,60 –62），而忽略了奈米塑膠大多是未知的。到目前為止，僅報導了使用技術組合的整體特性來分析瓶裝水中濃縮奈米顆粒的等分試樣。需要資訊來解決單顆粒層級上奈米塑膠汙染的內在異質性（SI附錄，圖S18a ）（63、64）。在這裡，我們報告了一個簡潔的工作流程，用於全面的微奈米塑膠表徵，透過 SRS 顯微鏡進行具有奈米靈敏度的快速單顆粒化學成像。一次測量即可獲得豐富的信息，實現化學成分和形貌的同時表徵，透過高通量單顆粒分析實現多維統計。
過濾是將超過一定尺寸的顆粒收集到膜表面上的最常見方法之一。如果收集的膜直接相容於 SRS 成像，那麼對於分析真實世界的樣本將是非常可取的。氧化鋁膜在目標光譜視窗中具有最小的背景，並且與振動光譜具有良好的兼容性。透過施加重水以減少折射率失配，看似不透明的氧化鋁膜可以輕鬆轉變為透明的成像視窗。這導致透射 SRS 成像具有可接受的訊號保留（原始靈敏度的約 70%，SI 附錄，圖 S7 b和c）。用 D2 O製備的瓊脂糖凝膠將顆粒原位嵌入膜表面，進一步實現了以最小的成像背景對單個顆粒進行靜態 SRS 成像。這樣，簡潔的樣品預處理就足以對原始濾膜進行高品質的SRS成像（SI附錄，圖S7a ），避免在任何複雜的樣品乾燥或轉移過程中出現不良的樣品損失或汙染。 採用高光譜 SRS 成像分析瓶裝水中微奈米塑膠暴露的既定工作流程如圖3所示。對於每個樣本，在SRS顯微鏡下的高光譜成像收集區域內隨機採樣五個或更多視場（FOV）（
圖3D ）。在每個視場中，透過整合數據分析工作流程檢測微奈米塑料，該工作流程使用開發的演算法和經過驗證的閾值條件自動執行顆粒分割和塑料識別。然後將從高光譜 SRS 影像中獲得的每個塑膠顆粒的形態和化學資訊結合起來，以提供高維分析（圖 3 E）。按照該程序，我們分析了從一家大型零售商同時購買的三個不同品牌的瓶裝水。由於實驗室無法取得無塑膠水（SI 附錄，補充說明 6），Anodisc 過濾器的製備和測量方式與空白對照相同。在結果中，我們能夠透過與相應的批量標準品的光譜匹配來明確檢測庫中所有七種塑料聚合物的單個顆粒（圖 4），這證明了我們的數據驅動的高光譜SRS 成像平台強大的塑料識別能力。 圖 3.
圖 4.
5. 瓶裝水中微奈米塑膠的多維分析
對具有已識別的塑膠聚合物成分的單顆粒圖像進行量化可提供多維信息，以構建瓶裝水中尚未開發的奈米塑料的分析全景。 透過顆粒計數進行數量量化表明，三個不同品牌的每個 FOV（0.2 mm × 0.2 mm）平均識別出 78 至 103 個塑膠顆粒，顯著高於空白樣品（P < 0.001）（圖 5 A）） 。假設微奈米塑膠顆粒均勻分佈在薄膜區域表面（SI附錄，補充說明5），我們可以對瓶裝水中的微奈米塑膠暴露量進行估算。我們估計平均大約有 2.4 ± 1.3測量不同品牌的每公升瓶裝水中攝取的105 個塑膠顆粒（圖5C ）。分別分析每種類型聚合物的單一顆粒，以揭示化學異質性。在該庫中，PA、PP、PET、PVC 和 PS 被發現可能在瓶裝水中微奈米塑膠暴露中發揮重要作用（圖 5 B）。微奈米塑膠的確切化學成分因品牌而異，但在我們分析的所有三個品牌中，PA似乎是數量上共同的主要貢獻者。 圖 5.
利用 SRS 強度與焦點體積內分析物數量之間的線性關係，我們也能夠提供顆粒數量以外的暴露質量估計。可以根據標準 PS 奈米球獲得的線性關係的密度和相對 SRS 強度來估計每種聚合物的質量校準曲線（SI 附錄，圖 S16）。因此，每個粒子的興趣區域內的積分強度被轉換為質量（圖 5 E和F）。據計算，微奈米塑膠暴露量估計約 10 ng/L。透過分析品質中的化學成分，我們發現按品質量化的貢獻和數量量化的貢獻之間存在著不可忽視的差異。以C品牌的結果為例。 PS奈米塑膠雖然在顆粒數量上占主導地位，但僅佔質量的一小部分。相反，PET 成為品質的主要貢獻者。這種看似的差異凸顯了集體顆粒表徵對塑膠成分的潛在誤解，這種誤解源自於現實世界樣品中微奈米塑膠的異質性。 SRS 顯微鏡對單一顆粒的形態表徵直接揭示了顆粒異質性的另一個維度。報告了具有明確身份的單一微奈米顆粒圖像的顆粒尺寸和形狀的統計分析。在測量尺寸分佈時，我們能夠透過從強度讀數推斷尺寸（假設顆粒為實心球）並使用顆粒體積與 SRS 訊號之間的線性關係作為校準來表徵低於衍射極限的顆粒（SI附錄，補充說明3）。結果，我們發現不同化學成分的塑膠顆粒實際上具有不同的尺寸分佈模式（圖6 A- G）。這裡對顆粒異質性的直接觀察提供了透過質量或數量測量觀察到的化學成分差異的自然解釋。以PS和PET為例：PS顆粒的尺寸分佈集中在100至200奈米左右，而PET顆粒的尺寸分佈往往接近1至2微米，這解釋了為什麼在質量測量時PET是更重要的成分而在計算顆粒數量時，PS 明顯占主導地位（圖 5 D和F）。 圖 6.
形狀是另一個重要的形態特徵，是奈米毒性的關鍵方面。研究表明，形狀在決定微奈米顆粒的細胞攝取方面發揮著重要作用 (65 ,66 )。塑膠顆粒的 SRS 影像證實了瓶裝水中微奈米塑膠存在形狀多樣性。為了以統計方式解釋塑膠顆粒的形狀，我們測量了高於衍射極限的單一顆粒的縱橫比（圖 6 H）。長寬比在奈米毒理學研究中已廣受認可 (67 ,68 )。檢測到的塑膠顆粒的長徑比範圍為1至6，顆粒的平均長徑比約為1.7。圖 6 I- M提供了縱橫比與顆粒形狀之間關係的示意圖。長徑比高於3的顆粒最有可能是纖維狀的，而長徑比低於1.4的顆粒則大部分是球形的。在所有檢測到的聚合物中都發現了塑膠顆粒的形狀變化，這證實了人們廣泛認可的觀點，即現實世界的微奈米塑膠具有不同的形態特徵。這個尺寸很難與研究實驗室通常研究的工程聚合物奈米顆粒相似，並且與現實生活中塑膠顆粒暴露及其不同物理化學性質（即尺寸、形狀）相關的毒理學後果尚未確定。
六、討論與結論
透過開發用於微奈米塑膠分析的數據驅動的高光譜SRS 成像平台，我們描述了一種提高奈米顆粒檢測靈敏度和聚合物識別特異性的方法，這使我們能夠開始解決奈米塑膠長期存在的知識差距。我們估計，普通瓶裝水中微奈米塑膠的暴露量為每公升 10
5 個顆粒的水平，這比之前報道的僅關註大型微塑料的結果高出兩到三個數量級（SI 附錄，表S4）（58 、59、61、69、70）。由於涉及人體暴露量的估計，這些值大大高於目前文獻中報告的值（56 , 71），這是新檢測到的塑膠顆粒奈米塑膠部分的結果。以前在傳統成像下看不見的微小顆粒實際上在數量上占主導地位，約佔檢測到的塑膠顆粒總量的 90%。其餘 10% 被確定為微塑料，其濃度約為每公升3 × 10 4 個顆粒（ SI 附錄，圖 S17），其中大多數顆粒尺寸低於 2 µm。較大顆粒（>2 µm）在常規光學顯微鏡下更容易識別，與報告的微塑膠分析處於同一數量級，取決於基於不同技術報告的檢測限制（SI附錄，圖S17和表S4））。我們的結果透過明確檢測現實樣品中的奈米塑料，證實了超過微米級的塑膠碎片。與自然界中許多其他顆粒尺寸分佈類似，儘管在傳統顆粒成像技術下是看不見或無法識別的，但奈米塑膠的數量比以前計算的大微米塑膠要多得多。由於較小尺寸的奈米粒子含有較少的立方體物質，因此在質量定量中也很容易忽略這些奈米塑膠。然而，考慮到這些奈米塑膠顆粒跨越生物屏障的能力，奈米顆粒儘管對質量測量的貢獻看似微不足道，但可能在毒性評估方面發揮主導作用( 72 , 73 )。
我們也發現許多偵測到的粒子呈現與任何標準都不一致的 SRS 光譜。事實上，我們的七種塑膠聚合物的小型庫只能佔 SRS 顯微鏡下成像的顆粒/點總數的約 10% 左右。使用振動顯微鏡對瓶裝水中的微塑膠進行分析也顯示出類似程度的識別率，顯示看似簡單的水樣本中存在複雜的顆粒成分（SI附錄，表S4）。從這個意義上說，如果我們假設所有檢測到的有機顆粒均源自塑膠[SEM-EDX或尼羅紅染色的定量結果也得出相同的假設(19 ,74 )]，則微奈米塑膠濃度可能高達10每公升6 個顆粒。然而，天然有機物的普遍存在當然需要與具有聚合物特異性的光譜學進行謹慎區分。此外，對不明顆粒的仔細研究表明，其他方面進一步增加了識別化學成分的複雜性。例如，某些顆粒在指紋區域中表現出與 PET 特徵兩個峰值（C=O 酯鍵：1,730 cm-1；C=C 雙鍵：1,615 cm-1）相同的特徵，但呈現出多種振動峰值位於高頻C-H 區域（SI 附錄，圖 S8 a- d）。與 PET 不同的聚合物材料不太可能同時顯示與標準 PET 光譜完美匹配的 C=O 和 C=C 振動特性。更合理的解釋是，它們是含有 PET 和其他成分的小雜聚集體，其 SRS 光譜是每個成分光譜的疊加。事實上，對於一些較大的物質，我們甚至可以捕捉聚集體內的空間化學異質性（SI附錄，圖S8 a、e和i）。奈米塑膠或其他天然有機物之間可能形成的雜聚集體長期以來一直被認為是奈米塑膠分析的潛在挑戰，並可能影響生物暴露中的毒理學結果（11）。現實世界樣本中此類異質聚集體的直接可視化支持了這種擔憂。對於其他可能在沒有PET 的情況下形成的雜聚集體，嚴格的鑑定將需要擴展光譜庫並改進SRS 顯微鏡或其他具有擴展光譜窗口的振動成像技術的分析演算法，以應對大規模顆粒異質性帶來的挑戰 (27 ,75 ,76 )。 另一個重要的見解是，粒徑分佈隨著不同的化學成分而變化，這表明顆粒形態和化學成分之間存在相互關聯。觀察到的塑膠成分和顆粒形態之間的非正交性挑戰了透過整體測量來表徵微奈米塑膠的傳統假設。以品牌C的分析結果為例，微納塑膠的整體測量結果表明，從成分分析來看，主要物質是PET，從形態分析來看，大多數塑膠顆粒的尺寸都在500 nm以下。假設這兩個維度是獨立的屬性，人們可能會有這樣的印象：C品牌瓶裝水中的大部分塑膠顆粒應該是粒徑在500奈米以下的PET顆粒。然而，我們的單顆粒分析結果呈現出明顯的差異：樣品中含有少量約微米尺寸的 PET 顆粒和大量尺寸低於 500 nm 的 PS 顆粒。 這種非正交性可能為理解、追蹤並最終防止可能的微奈米塑膠汙染源提供有價值的資訊。特別是在飲用水生產中，從井到瓶子(77 )的每個步驟都確認有塑膠汙染。不同塑膠聚合物之間發現的尺寸差異可能表明有關水生產過程中汙染源的寶貴資訊。例如，我們分析的三個品牌的瓶裝水包裝材料 PET 和 PE 具有相似的尺寸分佈模式，與其他聚合物相比，主要以微米尺寸為主。一個可能的解釋是，這類顆粒在運輸或儲存過程中從瓶包裝中新釋放出來，並忠實地保留在水樣本中。其他聚合物，如 PA、PP、PS 和 PVC，雖然不是包裝材料，但也有大量標識，很可能是在水生產之前或過程中引入的。 PP 和 PA 具有相同的廣泛尺寸分佈，廣泛用作水處理中的設備組件或助凝劑 (78 )。特別是，PA 是逆滲透 (79 ) 中最常用的薄膜材料，這是三個品牌共用的常見水淨化方法。 PVC 和 PS 具有有利於小型奈米塑膠的獨特尺寸分佈，可能更早表明汙染源。根據微塑膠分析，PVC 被確定為原水中最豐富的聚合物類型 (77 )。已知PS在水淨化(80 )中用作離子交換樹脂的主鏈材料。在水處理的後續步驟中，RO 薄膜可能會去除大顆粒的 PVC 或 PS，留下大部分奈米顆粒。 最後，顆粒形態和化學成分之間的相互連結對毒理學問題有深遠的影響。正如對工程奈米顆粒的研究表明的那樣，並且對塑膠顆粒的研究也開始表明，微奈米顆粒引起的毒性不僅與劑量有關，而且還與顆粒的物理化學特性及其對細胞相互作用和攝取的影響有關（81 ,82） 。就 C 品牌瓶裝水而言，PS 奈米塑膠加上少量 PET 微塑膠引起的細胞毒性可能與 PET 奈米顆粒所產生的效果不同。對微奈米塑膠進行真正的綜合毒性評估需要對塑膠顆粒進行多維表徵，並整合每個塑膠顆粒在化學成分和顆粒形態方面的不同特性。具有奈米顆粒敏感性和塑膠特異性的單顆粒成像為解決日益嚴重的毒性問題提供了不可或缺的資訊。它不僅能夠透過準確的暴露量化來進行塑膠顆粒分析，而且還具有直接可視化顆粒與生物相互作用的獨特潛力。因此，我們設想數據驅動的高光譜SRS成像平台將繼續透過擴展的光譜庫來彌合奈米級塑膠汙染的知識差距，以研究更複雜的生物和環境樣本。
7. 材料與方法
7.1.高光譜 SRS 顯微鏡。
高光譜 SRS 成像是在商業系統下進行的，該系統透過整合光譜聚焦定時和重組單元（SF-TRU，Newport Corporation）（ 38 ） 發送雙輸出飛秒雷射系統（InSight X3，Spectra-Physics）並耦合到多光子雷射掃描顯微鏡（FVMPE-RS，奧林巴斯）。SI 附錄中詳細描述了儀器和成像條件。
7.2.樣品製備。
不同尺寸的微奈米球PS標準品購自Thermo Fisher Invitrogen。 PET、PP、PE、PVC 和 PA 的微塑膠標準是透過冷凍磨機將亞厘米大小的塑膠托盤粉碎成粉末而獲得的。將懸浮在 RO 水中的顆粒鋪展在蓋玻片表面並乾燥，然後嵌入 D2 O 製備的 1% 瓊脂糖凝膠以進行 SRS 成像。詳細資訊請參閱SI 附錄。依照SI 附錄 中所述的程序，使用仔細清潔的玻璃裝置，將同一品牌的兩瓶水通過 0.2 µm 孔徑的 Anodisc 薄膜進行過濾。根據圖 3B將收穫膜夾在中間以進行 SRS 成像。詳細的協議可以在SI附錄中找到。
7.3.數據分析。
SI 附錄 中詳細描述了 SRS 定制的光譜匹配演算法、合成數據生成和自動化微奈米塑膠檢測的方法。對應的 MATLAB 程式碼可透過以下連結在 GitHub 上取得：
https://github.com/qnxcarnation/SRS-tailored-Spectral-Matching-algorithm-for- Plastic- identification.git 。
數據、材料和軟體可用性
用於模擬、光譜匹配和塑性分析的 MATLAB 程式碼；原始成像資料已儲存在 GitHub 和 Figshare 中（https://github.com/qnxcarnation/SRS-tailored-Spectral-Matching-algorithm-for- Plastic-identification.git (83 )；和https://doi.org /10.6084/m9.figshare.24635793.v2）（84）。所有其他數據均包含在手稿和/或SI 附錄中。
致謝
我們感謝資料科學家 Tingran Wang 和 Mariam Avagyan 對演算法的討論。我們感謝哥倫比亞大學科學與工程研究計畫(RISE)、哈德遜河基金會、曼哈頓北部NIEHS 環境健康與正義中心(NIEHS P-30-ES009089) 和羅格斯環境暴露與疾病中心(NIEHS P-30 -ES009089) 的支持。
作者貢獻
NQ、BY 和 WM 設計的研究； NQ、HD 和 TMB 進行了研究； XG和XL貢獻了新的試劑/分析工具； NQ、XG、QC、PS 和 BY 分析資料； NQ、PS、BY 和 WM 撰寫了這篇論文。
利益爭奪
作者聲明沒有競爭利益。
